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无需抗体的蛋白定量技术L-WB(PRM)实验流程与应用 
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在蛋白组学中,蛋白验证实验是十分关键的一步,而提到蛋白验证,首先想到的便是Western Blot。Western Blot的实验原理是基于抗原抗体反应,通过相应的抗原抗体反应,从而验证不同处理样本间的蛋白表达水平的变化。然而并不是所有的蛋白都能找到相应的商业化抗体,另一方面自行设计合成抗体之路又是费时费力。即使现有的抗体也面临着特异性、稳定性难以保障的瓶颈,而且通量低、成本高。因此,传统WB在多方面限制了差异蛋白的验证,限制了课题的进一步开展




PRM技术介绍



随着质谱技术的飞速发展,基于质谱的蛋白质组学在灵敏度、精确度、分辨率方面都有了极大的提升。PRM(Parallel Reaction Monitoring,平行反应监测)质谱技术的出现,很好的解决了Western Blot技术的局限性,通量高,可同时验证几十个蛋白,因此大大降低了单蛋白验证的成本,且前处理后的样本直接上质谱检测,无需抗体,摆脱了抗体依赖,提高了验证的准确性和成功率。


SRM技术是一项经典的蛋白组学靶向技术,也是靶向蛋白组学的金标准。SRM技术首先锁定母离子和其子离子,后续依赖三重四级杆(QqQ)进行检测。而PRM技术则是更进一层,用高分辨率质量分析器Orbitrap替代了三重四极杆的第三个四极杆,从而可以在一个统一的高分辨率质量分析中平行检测所有目标产物离子参考文献[1],能够将干扰信息和真实的信号进行区分,从而保证更好的分析选择性。




PRM技术优势



● 1.继承了SRM技术的高灵敏度和特异性,由于Orbitrap的高分辨率和精准度,其灵敏度和特异性比SRM技术更高。

● 2.仅需要母离子的信息,即可进行实验,无需像SRM技术那般需要母离子/子离子对信息。

● 3.抗干扰能力强,排除虚假母离子/子离子对信息带来的信息干扰。

● 4.无需抗体,对不存在商业化抗体的蛋白验证,大幅度降低实验成本和实验时间。

● 5.重现性好,可以在多次重复检测中保证结果的稳定性。




PRM技术应用



● 受到物种和抗体等原因限制的蛋白验证实验;

● 蛋白质组学(DIA、iTRAQ、TMT等)后的差异目标蛋白验证;

● 临床疾病标志物的验证;

● 植物抗逆性研究标志物的验证;

……




PRM实验流程概述



1.选择待验证的蛋白。可以通过shot gun鉴定信息、分子生物学实验、文献报道等方式获得蛋白信息。

2.选取合适的实验组和对照组样品,进行前处理实验和DDA检测。

3.根据DDA搜库结果,skyline软件建库信息挑选可靠的靶向肽段(根据蛋白unique肽段数决定,2-5条肽段最佳)。

4.按照一定比例在样品中添加内标肽段iRT参考文献 [21],进行PRM检测。

5. 检测结果分析,包括内标肽段的质控、样品重复性验证等。



Q
&
A


01.PRM是用什么做内标?又如何实现的内标定量?这些操作在skyline里面都可以得出结果吗?有没有其他的软件也可以做PRM的?


鹿明生物目前使用的是商业化的iRT标准肽段作为内标的,主要进行保留时间的校正,也可以通过每条内标肽的峰面积积分的cv判断定量的准确性。所有的峰图和定量数据均可以由skyline导出。除了Skyline,Biognosys公司的SpectroDive软件也可以做PRM,且更为方便快捷,鹿明生物也即将推出,敬请期待!





02.做PRM是否还需要WB验证?


PRM和WB是完全基于两种不同的原理进行的,当然也各有优势,也可同时使用。对于几十个靶标蛋白来说,使用WB显然是成本高且不易实现,此时使用PRM就很容易完成。不过,如果老师通过各种生理指标和功能分析又进一步缩小了靶标蛋白的范围,得到几个尤其关注的biomarker,且能找到合适的抗体,那么在PRM验证的基础上,再加上WB的验证结果,双重保障,那您发文章的时候就是无懈可击啦。





03.做验证可以只用PRM验证吗?还需要用WB或Luminex等进行验证吗?


只应用一种验证方式是没有问题的,当然使用多种互相验证更是锦上添花。PRM验证是其中的一种方式,可依据验证方法的优势进行选择。





04.如果定量一个蛋白做PRM,一般要选几个肽段来做定量?


一般来说,一个蛋白能挑选出2-3条unique peptide,且这些肽段满足无漏切、无可变修饰,且intensity不要太低,出峰完整即可。如果确实满足不了2-3条,那么至少要有1条肽段满足以上所有条件。





05.请问N-糖基化蛋白组学找到的靶蛋白,定量验证用PRM可以吗?如果不可以,需要用什么方法?


这方面是有文献报道的(文献链接https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4708883/),不过由于修饰基团的不稳定性,用PRM做修饰组学的验证目前还没有大面积普遍应用。





06.请问PRM需要对每一个选定的肽段做质谱能量等参数的优化吗?


不需要的。b/y离子的断裂生成的碰撞能量一般是比较固定的,另外由于PRM是扫描全部二级子离子,所以也不用像MRM一样去挑选母子离子对。





07.如果怀疑有一个非编码RNA编码一个新的多肽,可以用这个方法鉴定找到和这个新的多肽相互作用的蛋白或者核酸吗?


已知新肽段序列的前提下,PRM可用于确证该新多肽是否存在。与其相互作用的蛋白则需要做IP等实验进行富集,之后进行一般的LC-MSMS鉴定就可以了。





08.PRM用什么做内参来比较目的蛋白在不同组的表达量呢?


基于质谱的PRM实验中,质谱采集到的是实际样品中进入检测器的碎片信号,我们只需要比较不同组之间目的蛋白的相对信号强度即可(也可加入标准品,做绝对定量)。当然,在设置目的蛋白列表的时候,除了差异蛋白,也可以选择几个管家蛋白做内参,非必须要求。





09.做病毒感染机制用PRM技术这方面有具体案例吗?


目前我们还没有遇到该类的样本,不过以下文献是竹子抗真菌感染的,应用了PRM技术,供参考:https://www.ncbi.nih.gov/pmc/articles/PMC6724075/pdf/metabolites-09-00166.pdf如果您有这方面的项目需求,可以扫码文末小鹿咨询专业的技术工程师,进行深入沟通和方案设计。





10. PRM技术手段和蛋白芯片手段相比较,在灵敏度和效率方面有优势吗?


首先,PRM和蛋白芯片的原理和应用方向是不同的,各有优势。但是单纯讲灵敏度和效率的话,PRM会更高一些。质谱仪器目前已经发展的比较成熟,从四级杆到质量分析器等各个配件上均使得灵敏度和分辨率大大提高,可检测低至amol(10-18)的肽段信号。效率方面,前处理只需常规酶解、除盐,然后直接上质谱检测,单针PRM可同时检测40+个蛋白,90min梯度即可采集完成。





11.目的蛋白具有跨膜结构域,但是可以被其它蛋白酶切下来形成无跨膜的蛋白,形成两种蛋白形式,能利用PRM分别定量吗?


两个不同的蛋白,只要分别具有各自的ID号,且序列同源度不高,能找到各自符合条件的酶切后的unique peptide,就可以分别定量。





12.请问实验想区分成熟蛋白与蛋白前体比例,验证蛋白加工环节差异,可以用PRM解决吗?


蛋白前体加工过程种类繁多,如氨基酸的修饰、构象形成、高级结构修饰等,PRM技术主要检测氨基酸序列,所以如果蛋白加工环节有氨基酸序列的变化,且该变化的肽段是胰蛋白酶酶切后的unique peptide,则可对变化前后的unique peptide定量,从而反映蛋白加工前后的变化。





13.老师刚才说建库是分10个馏分吗?


我们目前做馏分建库是分10个的(实际共接40个馏分,然后头尾合并为10个进行质谱上机),与DIA相同,如果前期做过DIA建库,那么PRM可以直接使用,无需重复建库。





14.一次PRM实验最多选择多少个蛋白验证呀?


建议40个蛋白左右。





15.你们PRM只用iRT做内标吗?不用合成同位素肽段内标?


是的,我们目前只做相对定量。如果加入同位素标记肽段的话,可以做绝对定量。





16.如果建库用的是预分的方法,比如预分10份,那么像plasma这种样本,对样本进行PRM检测时,不进行预分可以吗?


不仅对于plasma,其他样本类型后续进行PRM单针也不需要做预分的,因为在前期预分建库之后,我们已经提出了目的蛋白的质荷比和保留时间等信息,根据其将方法设置好,直接做PRM扫描即可。





17. 膜蛋白和核蛋白可以在一份材料中同时进行PRM定量吗?


PRM本身只是一项检测技术,它不区分我们的样品是定位在哪个亚细胞结构的,只要前处理提取到足够的蛋白,均可以检测。





18. 如果蛋白含量很低,质谱检测不到,这样的蛋白可以做PRM吗?


如果浓度已经低于检测限了,采集不到谱图,也只能说“臣妾做不到啦☺” ,毕竟PRM只是质谱的一种扫描方法。





19.两个蛋白的序列差异只有10aa,能区分开吗?


如果总氨基酸序列只有10aa的差异, 说明其总的氨基酸序列绝大部分是相同的,不过如果差异部分酶切后至少包含1条符合条件的unique peptide,也是能区分开的(可能需要合成稳定同位素内标肽)。






20.做PRM需要重新送样吗?还是拿之前蛋白组学的样本直接做?(之前已经做过蛋白质组学)


这个要根据实验目的进行选择。如果从技术准确性的角度验证前面蛋白质组的结果是否可靠,那么可以采用之前的样本进行PRM确证。如果是为了从生物学角度验证实验结论,那么建议用新样本做生物学验证。后者的一致性存在风险,因为不同的生物体、不同生长阶段等变化都会导致蛋白表达的少许差异,再加上复杂样本在制备、酶解等前处理过程中有一定的随机性,有可能会出现蛋白表达上下调不一致的情况。


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