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单细胞解离实验经验分享

 
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样本解离作为单细胞实验的第一道门户,结果质量直接决定整个项目的成功与否,其重要性不言而喻。但是很多老师和同学在开展单细胞实验伊始,总是会碰到各种各样的问题。


为了帮助大家制备出高质量的单细胞悬液,小编专门采访了Kate张,就单细胞悬液的制备中那些让人“头疼”的问题,为大家一一解答。

Q1


问:达到怎样的要求才算高质量的单细胞悬液呢?


答:主要为以下几个判断标准:在总细胞量高于105的前提下

1.镜检结果显示红细胞占比低于4%;

2.碎片/其他杂质占比低于4%;

3.细胞团数量占比低于4%;

4.细胞活性高于85%,并能半小时内保持活性不变。


Q2


问:组织需要剪非常碎吗?一般剪碎到什么程度比较好呢?


答:是的,一般组织剪得越碎,在消化过程中与酶解液接触越充分,越利于消化。我们一般将组织剪碎至1-2mm3的糜状,如下图1

图1 | 剪碎后的组织


Q3


问:一般细胞的离心力在多少最佳?


答:我们正常离心力在300g左右,有时会根据细胞具体情况作调整。


Q4


问:如果细胞沉淀非常红,可以多加点红细胞裂解液吗?


答:一般情况下不建议多加裂红液。一般红细胞裂解液有推荐的红细胞裂解液/细胞悬液的体系,增大体系可能影响到细胞活性。所以,红细胞裂解不干净,建议增加裂红时间,或增加裂红次数。


Q5


问:假设制备出的单细胞,细胞量比较多,但是活性不高,如何提高活性呢?


答:可以尝试一下去死细胞试剂盒,根据我们操作经验,细胞活性在60%-75%区间时去死细胞提高活性的效果较好。

图2 | 去死细胞试剂盒


Q6


问:假设细胞悬液中碎片比较多,要怎么去除呢?


答:建议尝试以下3点去除:

1.降低离心力,多次洗涤,或密度梯度离心;

2.用血清重悬细胞,离心洗涤,可去除部分碎片;

3.去碎片试剂盒,根据我们操作经验,大块的碎片去除效果较好。

图3 | 去碎片试剂盒


Q7


问:如果细胞悬液中有比较大的结团,要怎么去除呢?


答:可以轻柔地多吹打几次,无法吹开可用40μm细胞筛过滤去除。


Q8


问:倘若细胞消化下来后,还没进行处理细胞活性就往下降了,这要怎么办?


答:根据我们的经验,可能有以下2种可能。

1.可能与解离体系有关,建议尝试加入一些辅助酶,例如:DNA酶,透明质酸酶等辅助消化,减少酶解液对细胞状态的影响;

2.消化过程是否太过剧烈,例如:旋转消化转速过高或震荡消化震荡剧烈都有可能对细胞状态造成影响。

Q9


问:要是镜检细胞用的台盼蓝,镜检下不知道有一些是不是细胞,这个要怎么判断呢?


答:建议尝试用荧光染料对细胞进行染色,再行镜检,对比明场与荧光即可判断。


Q10


问:为什么没染色的时候细胞形态挺好的,台盼蓝一染色就有挺多片状的碎片啊?


答:可能是因为台盼蓝里的碎片,建议将台盼蓝过一下0.22μm的过滤器之后再镜检。



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